凝胶渗透色谱测试天然橡胶相对分子质量及分布的优化方法建立
天然橡胶是重要和不可替代的国家战略性物资。天然橡胶的物理性质如拉伸性能、动态力学、硫化特性、加工性能、热稳定性等与其相对分子质量及分布息息相关。天然橡胶是典型的高分子材料，分子量是表征高分子材料性能的重要指标，因此相对分子质量及分布的测试显得尤为重要[1][2]。天然橡胶是一种以聚异戊二烯为主要成分的天然高分子化合物，目前测试高分子化合物的平均分子量方法有很多种，凝胶渗透色谱（GPC）是应用最为广泛的方法之一，具有快速、操作简便和自动进样等优点[3][4][5]。据报道，张毅等[6]用聚苯乙烯为标准品，使用多孔硅胶填充的玻璃柱，用泵输送淋洗液，以自动收集器收集淋出级分，提出了简易凝胶渗透色谱法测定天然橡胶分子量分布。马翠芳等[7]提出了用凝胶渗透色谱测定液体橡胶分子量及分布方法的建立。王喜云等[8]等研究了浓度、流量、温度对凝胶渗透色谱—十八角激光散射仪测试高分子量及其分布的影响等。但目前关于凝胶渗透色谱仪测试天然橡胶相对分子质量及其分布的仪器测试条件（流动相、温度、流速、进样体积等因素）的相关研究报道较少，因此探索影响天然橡胶相对分子质量及分布的凝胶渗透色谱仪器测试条件对于正确评估天然橡胶性能具有重要的作用。在充分借鉴国际标准化组织最新修订方法（ISO 16564-2004）的基础上，本试验采用凝胶渗透色谱对同一天然橡胶样品的相对分子质量及分布进行测试，以聚苯乙烯为标准品，比较不同测试条件如不同的流动相、流速、柱温、检测器温度以及进样体积等因素对天然橡胶相对分子质量及分布测试的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验所选用的材料为中国热带农业科学院橡胶研究所儋州基地种植的9年树龄的‘热研73397’橡胶树，取正常割胶胶乳1L加入5mL冰醋酸，凝固1晚，经过压干机除去多余水分后放入烘箱中，70℃烘24h，得到原胶为试验样品。称取30mg试验样品溶于10mL四氢呋喃溶液中，静置溶解7d后，用材质为PTFE滤膜（孔径为0.45μm）过滤后，滤液为待测样品。
1.2 仪器及试剂
仪器：凝胶渗透色谱系统（美国Waters公司），1515色谱泵、2414示差折光检测器，自动进样系统，Breeze 2数据处理软件。
色谱条件：WAT054460(7.8mm×300mm）凝胶柱。
试剂：四氢呋喃（THF),HPLC级（美国TEDIA公司）；聚苯乙烯标样（美国Waters公司）。
1.3 试验方法
本试验探索仪器测试条件（流速、柱温、进样体积）对天然橡胶相对分子质量及分布测试的影响，固定柱温和检测器温度为40℃、进样体积为30μL的条件，改变流速对天然橡胶样品进行测试；固定流速为1.0mL/min，进样体积为30μL的条件下，改变温柱和检测器温度对天然橡胶样品进行测试；固定流速为1.0mL/min，柱温和检测器温度为40℃的条件下，改变进样体积对天然橡胶样品进行测试。
2 结果与分析
2.1 流动相的选择
凝胶渗透色谱选择流动相的原则是对样品具有较好的溶解性，且不与样品和凝胶柱填料发生反应[9]。四氢呋喃、三氯甲烷、甲苯和苯对天然橡胶样品具有很好的溶解性，且不与样品和凝胶柱填料发生反应。另一方面，作为凝胶渗透色谱的流动相，还应具有粘度小、折光指数低、操作温度适中，低毒、价格便宜等优点，结合表1所列的4种常见的溶解天然橡胶溶剂的物理参数[10]来看，四氢呋喃最适合作为天然橡胶分子量测试的流动相。同时，天然橡胶相对分子质量及分布测试选择溶解样品的溶剂应尽量与流动相相同，可以减少系统误差对相对分子质量及分布测试带来的影响。因此，综合考虑选择四氢呋喃作为溶解样品的溶剂和凝胶渗透色谱的流动相。
2.2 流速的选择
在柱温和检测器温度为40℃，进样体积为30μL的条件下，改变流速测得的分子量数据如表2所示。从表2可知，数均分子量（Mn）的均值为346224，重均分子量（Mw）的均值为1601572,Z均分子量（Mz）均值为2951779，多分散性（PD）的均值为4.631。流速的改变影响最大的是样品的出峰时间，随着流速从0.2mL/min增加到1.0mL/min，样品出峰时间越来越快，而Mn、Mw、Mz也随着流速的增加而变大。当流速为1.0mL/min时，分散系数最小（4.462），出现这种情况的原因可能是因为随着流速的增加，溶液中的大分子受到的力发生改变，使得分子大小和分子形状发生改变，导致光散射强度增加，至于详细机理有待进一步研究。
2.3 温度的选择
在流速为1.0mL/min，进样体积为30μL的条件下，同时改变柱温和检测器温度测得的分子量数据如表3所示。由表3可知，数均分子量（Mn）的均值为321233，重均分子量（Mw）的均值为1521865,Z均分子量（Mz）的均值为3000226，多分散性（PD）的均值为4.753。随着温度从32℃增加到40℃，Mn、Mw、Mz也随之增大，这可能是因为柱温的升高会使大分子在凝胶柱上的吸附减少，溶液的粘度降低，分子扩散速度增大，柱效表现出增加的倾向[11]。同时，在40℃时，分散度（4.462）相对来说较小。
表1 4种常见溶剂的物理参数
表2 不同流速下测得的分子量及分子量分布数据
表3 不同温度下测得的分子量及分子量分布数据
表4 不同进样体积测得的分子量及分子量分布数据
图1 不同进样量对色谱峰的影响
2.4 进样体积的选择
在流速为1.0mL/min，柱温和检测器温度为4 0℃的条件下，将样品分别按照1 0μL、20μL、30μL、40μL、50μL的进样量注入凝胶渗透色谱系统进行测试，结果见图1和表4。从图1和表4可以看出，不同的进样体积，测得的数均分子量（Mn）的RSD为2.160%，重均分子量（Mw）的RSD为3.734%,Z均分子量（Mz）的RSD为2.330%，多分散性（PD）的R S D为1.6 5 0%，均小于凝胶渗透色谱测试RSD≤5%的要求，说明进样体积对样品峰型和测试结果影响比较小。但是考虑到进样体积为10μL时，信号强度低、峰面积小，在数据处理过程中可能会导致更大的误差；进样体积增加到50μL时色谱峰明显加宽，同时出峰时间会拖后，相对分子量质量均变小，相对分子质量分布会变窄（多分散性会变小），不仅不利于样品的分离，还可能会导致色谱柱出现“过载”现象，降低色谱柱使用寿命。
图2 聚苯乙烯标准品校正曲线
表5 数据结果准确度分析
表6‘热研73397’天然橡胶样品分析结果
图表7 常见的9种天然橡胶相对分子量及分布的测定结果
2.5 校正曲线的绘制
选用相对分子质量不同的8种聚苯乙烯系列标样绘制标准曲线（第1组：Mp=56600、740000、2830000；第2组：Mp=129000、1700000、3580000；第3组：Mp=740000、2330000），配制浓度为1mg/mL的溶液，在流动相为四氢呋喃、流速为1.0mL/min、柱温和检测器温度为40℃、进样体积为30μL的条件下进行标样测试，用标样的保留时间对LogMw作图（图2），得到标准曲线方程为LogMw=29.338-7.0685x+0.759x2-0.0293x3，线性相关系数为0.99994，所绘制的标准曲线适用于相对分子质量为56600～3580000的橡胶。
2.6 方法的准确度与重现性
2.6.1 方法的准确度
用相对分子质量为1.70×106,PD=1.04的聚苯乙烯标样来检测仪器，配制1.0mg/mL的溶液，在校正曲线（2.5）同等测试条件下重复测试3次，记录实际测量数据并进行准确度计算，结果见表5。从表5可见，聚苯乙烯（1.70×106）的实测值与真实值非常接近，准确度达到98%以上，实测数据的相对标准偏差小于5%，相对误差远远低于凝胶渗透色谱允许误差小于20%[12]的要求，说明仪器测试性能稳定，结果理想，该方法准确可靠。
2.6.2 方法的重现性
在与标准曲线同等测试条件下对同一样品测试6次，结果见表6。从样品重叠图谱和测试结果来看，6次测试的图谱重叠较好，6次测试的数均分子量（Mn）的RSD为2.105%，重均分子量（Mw）的RSD为2.540%,Z均分子量（Mz）的RSD为2.722%，多分散性（PD）的RSD为4.387%，多次测试结果满足GPC重复性（<5%）要求，说明测试方法具有良好的重现性和再现性。
2.7 常见不同品种的天然橡胶分子量及分布测试
在与标准曲线相同测试条件对常见的9种天然橡胶样品进行测试，结果见表7。
3 讨论
采用凝胶渗透色谱测试天然橡胶相对分子质量及分布具有操作方便快速、准确度高、重现性好的优点。
改变凝胶渗透色谱仪器测试条件，比较天然橡胶相对分子质量及分布测试结果的大小。考虑流动相应具有粘度小、折光指数低、低毒等优点，建议选择四氢呋喃作为凝胶渗透色谱测试天然橡胶分子质量及分布的流动相和样品溶解溶剂。随着流速从0.2mL/min增加到1.0mL/min，样品出峰时间越来越快，相对分子质量也随之增大，而多分散性随着变小，因此建议测试天然橡胶分子质量及分布时选择流速为1.0mL/min。随着柱温和检测器温度从32℃增加到40℃，相对分子质量也随之增加，但在40℃时，分散度（4.462）相对来说较小，考虑在温度为40℃时溶液粘度降低、柱效增加等问题，建议测试天然橡胶分子质量及分布时柱温和检测器温度选择40℃。比较不同的进样体积（10μL、20μL、30μL、40μL、50μL）对天然橡胶分子质量及分布测试的影响，结果表明进样体积对样品峰型和测试结果影响比较小，但考虑到进样体积为10μL时，信号强度低、峰面积小，在数据处理过程中可能会导致更大的误差；进样体积为50μL时色谱峰明显加宽，还可能会导致色谱柱出现“过载”现象，降低色谱柱使用寿命。因此，综合考虑，建议进样体积选择30μL。
4 结论
本研究报道了凝胶渗透色谱仪器条件对天然橡胶分子质量及分布的影响，确定了最佳的凝胶渗透色谱测试天然橡胶分子质量及分布的条件：检测器为示差折光检测器，流动相为四氢呋喃，流速为1.0mL/min，柱温和检测器温度为40℃，进样体积为30μL。这些研究将为今后利用凝胶渗透色谱测试天然橡胶分子量及其分布时，仪器测试条件对天然橡胶样品分子量及其分布测试影响提供试验指导和理论基础。
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